澳門(mén)大學(xué)羅茜組構(gòu)建斑馬魚(yú)模型實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞水平實(shí)時(shí)觀察NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用

作者：luojiao 發(fā)布時(shí)間：2022/8/22 9:00:00

近年來(lái)，腫瘤免疫治療取得了十分重要的進(jìn)展?；赥細(xì)胞和CAR T細(xì)胞的療法已經(jīng)在臨床上用于多種腫瘤的治療。然而，T細(xì)胞療法存在細(xì)胞因子釋放綜合征（cytokine release syndrome）和移植物抗宿主病（graft versus host disease）等副作用。作為另外一種策略，基于NK細(xì)胞的腫瘤免疫療法逐漸吸引業(yè)界的關(guān)注。NK細(xì)胞可以不經(jīng)過(guò)抗原識(shí)別直接殺傷腫瘤細(xì)胞。相較T細(xì)胞而言，基于NK細(xì)胞的療法對(duì)健康組織的免疫攻擊更不易發(fā)生，副作用更小。為了增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷效果，多種新型的治療性NK細(xì)胞正在被開(kāi)發(fā)出來(lái)，比如臍帶血NK細(xì)胞，干細(xì)胞來(lái)源NK細(xì)胞，過(guò)繼性NK細(xì)胞，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的記憶樣NK細(xì)胞和CAR NK細(xì)胞等。這些新型的治療性NK細(xì)胞的殺傷效果需要合適的動(dòng)物模型來(lái)評(píng)價(jià)，可靠且簡(jiǎn)便的動(dòng)物模型能夠有效地促進(jìn)NK細(xì)胞療法的開(kāi)發(fā)。

NK細(xì)胞主要通過(guò)死亡受體途徑（death receptor pathway）和殺傷性顆粒途徑（cytotoxic granule pathway）介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞。傳統(tǒng)常用的評(píng)價(jià)NK細(xì)胞殺傷效果的方法為鉻釋放試驗(yàn)（chromium release assay）。該方法采用放射性同位素鉻標(biāo)記靶細(xì)胞，靶細(xì)胞被NK細(xì)胞殺死后，根據(jù)靶細(xì)胞釋放的鉻來(lái)判斷NK細(xì)胞的殺傷活性。鉻釋放試驗(yàn)可以較為準(zhǔn)確的測(cè)定NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷，但是，鉻的放射性影響了該方法的使用。鑒于此，具有熒光的鈣黃綠素（calcein）被用來(lái)替代鉻進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記。然而，鈣黃綠素對(duì)有些細(xì)胞的標(biāo)記較差，且隨著細(xì)胞的增殖熒光會(huì)被稀釋，故不適合長(zhǎng)時(shí)程跟蹤。

羅茜團(tuán)隊(duì)在之前的研究中，利用基因工程技術(shù)，開(kāi)發(fā)了一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）的蛋白熒光探針sensor C3用于細(xì)胞凋亡的實(shí)時(shí)跟蹤。該探針在活細(xì)胞中發(fā)出綠色熒光，而在凋亡細(xì)胞中，構(gòu)成sensor C3的CFP和YFP之間的氨基酸序列被活化的caspase-3切割，F(xiàn)RET被中斷，從而探針發(fā)出藍(lán)色熒光。本研究中，基于sensor C3，并結(jié)合循環(huán)系統(tǒng)標(biāo)記的斑馬魚(yú)Tg(fli1:EGFP)，該團(tuán)隊(duì)建立了一種可以在體內(nèi)實(shí)時(shí)地觀察腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散和NK細(xì)胞殺傷的動(dòng)物模型。作為一種強(qiáng)大的體內(nèi)工具，該模型可以用來(lái)評(píng)價(jià)基于NK細(xì)胞的免疫療法的治療效果。2022年8月6日，此項(xiàng)研究以“Visualization of natural killer cell-mediated killing of cancer cells at single-cell resolution in live zebrafish” 為題發(fā)表于國(guó)際知名期刊Biosensors and Bioelectronics上。

作者首先建立了體外3D培養(yǎng)模型來(lái)研究NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷（圖1）。作者使用sensor C3標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，紅色熒光蛋白（tdTomato）標(biāo)記NK-92MI細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞和NK細(xì)胞混合后，共同培養(yǎng)在非貼壁孔板。結(jié)果顯示，在腫瘤細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)的對(duì)照組，很少出現(xiàn)藍(lán)色的凋亡細(xì)胞。而在共培養(yǎng)組，6小時(shí)后即出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，36小時(shí)后，腫瘤細(xì)胞幾乎全被NK細(xì)胞殺死。
 

圖1 體外3D培養(yǎng)模型顯示NK細(xì)胞可以誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡

然后，作者將腫瘤細(xì)胞和NK細(xì)胞通過(guò)顯微注射的方法在總主靜脈（common cardinal vein, CCV）處注射到斑馬魚(yú)幼魚(yú)。注射后6小時(shí)，可以看到腫瘤細(xì)胞分散到軀干和尾部。在腫瘤細(xì)胞單獨(dú)注射對(duì)照組，很少有藍(lán)色凋亡細(xì)胞，而在共注射組，有大量凋亡細(xì)胞（圖2A）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞凋亡的峰值出現(xiàn)在注射后12小時(shí)，且NK細(xì)胞可以在36小時(shí)內(nèi)幾乎殺死全部腫瘤細(xì)胞 （圖2B, C）。
 

圖2 斑馬魚(yú)腫瘤模型顯示NK細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷

大視野全身成像技術(shù)展示了顯微注射8小時(shí)后，腫瘤細(xì)胞在斑馬魚(yú)體內(nèi)的分布和NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷 （圖3A）。而高分辨率成像則更好地展示了NK細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的相互作用。比如，NK細(xì)胞會(huì)緊密地粘附腫瘤細(xì)胞，甚至?xí)淖冏约旱男螒B(tài)來(lái)更好地殺傷腫瘤細(xì)胞（圖3B）。
 

圖3 大視野和高分辨成像顯示NK細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷

為了研究NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過(guò)程，作者進(jìn)行了實(shí)時(shí)成像（圖4）。如圖所示，在顯微注射4小時(shí)10分鐘后，一個(gè)NK細(xì)胞識(shí)別到一個(gè)乳腺癌細(xì)胞， 35 分鐘后，該乳腺癌細(xì)胞開(kāi)始由綠變藍(lán)，意味著caspase-3的活化。4小時(shí)55分鐘后，腫瘤細(xì)胞徹底變?yōu)樗{(lán)色，同時(shí)NK細(xì)胞開(kāi)始遷移向另外一個(gè)腫瘤細(xì)胞。
 

圖4 實(shí)時(shí)成像顯示NK細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷

澳門(mén)大學(xué)健康科學(xué)學(xué)院羅茜教授為論文通訊作者，博士研究生楊紅梅和博士后研究員賈皓為論文共同第一作者，趙琦教授參與了相關(guān)研究工作。澳門(mén)大學(xué)健康科學(xué)學(xué)院動(dòng)物研究核心實(shí)驗(yàn)中心和生物成像及干細(xì)胞核心實(shí)驗(yàn)中心提供了重要支持。這項(xiàng)研究得到了澳門(mén)大學(xué)MYRG研究基金和澳門(mén)大學(xué)健康科學(xué)學(xué)院的資助